一、蛋白樣品的制備與定量

蛋白樣品制備是 Western Blotting 的第一步，也是決定 WB 成敗的關(guān)鍵步驟之一。蛋白提取總體原則與注意事項(xiàng)包括：1) 盡可能提取完全或降低樣本復(fù)雜度使得集中于提取目的蛋白；2) 保證蛋白處于可以溶解狀態(tài)（選擇合適的裂解液的pH 、鹽濃度、 表面活性劑、還原劑等）；3) 提取過程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修飾等（冰盒中低溫操作，加入合適的蛋白酶和磷酸酶抑制劑）；4) 盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。蛋白定量的方法有很多種，應(yīng)用較多的主要有兩種：BCA蛋白定量檢測法和Bradford蛋白定量檢測法，用RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品，可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，由于含有較高濃度的去垢劑，不能用Bradford法測定由RIPA裂解液裂解得到樣品的蛋白濃度。

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百瑞極RIPA組織/細(xì)胞裂解液（BN25011）是一種傳統(tǒng)的細(xì)胞組織快速裂解液，得到的蛋白樣品可用于常規(guī)的Western、IP等實(shí)驗(yàn)。RIPA裂解液種類很多，根據(jù)其裂解液的強(qiáng)度不同分為強(qiáng)、中、弱三類，請根據(jù)檢測樣本與檢測目的的不同選擇適當(dāng)?shù)牧呀庖骸?nbsp;

百瑞極蛋白酶抑制劑Cocktail（BN25002)由6種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑（不含 EDTA）按照優(yōu)化的配比配置而成的蛋白酶抑制劑混合物,作用的靶點(diǎn)分別為絲氨酸蛋白酶，絲氨酸半胱氨酸蛋白酶，氨肽酶，半胱氨酸蛋白酶 和天冬氨酸蛋白酶等，是廣譜蛋白酶抑制劑。

百瑞極BCA蛋白濃度測定試劑盒（BN27109)是一種靈敏并且抗干擾能力強(qiáng)的蛋白定量檢測試劑盒，對去垢劑耐受能力強(qiáng)，特別適合用于 RIPA 裂解液提取的細(xì)胞和組織蛋白樣品中的蛋白濃度測定。 

二、SDS-PAGE電泳

樣品制備完成后，需要通過電泳將不同分子量大小蛋白有效分開，以便能夠檢測目的蛋白的表達(dá)水平，廣泛采用的是SDS-PAGE，在電泳體系中加入變性劑SDS和還原劑DTT或者巰基乙醇等，蛋白質(zhì)分子的多聚體或者高級結(jié)構(gòu)會被打開，蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合形成蛋白-SDS復(fù)合物，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)原有的電荷量，因此可以有效消除不同蛋白質(zhì)分子間的電荷差異和空間結(jié)構(gòu)差異。所以SDS-PAGE檢測時(shí)，可以利用分子篩效應(yīng)將蛋白質(zhì)依據(jù)分子量大小分離開來。

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百瑞極彩虹245廣譜蛋白Marker(11-245KD,BN27002)包含12種彩色預(yù)染的已知分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，可用于直接觀察蛋白質(zhì)電泳狀況以及清晰地判斷Western Blot的轉(zhuǎn)膜效果。

百瑞極SDS-PAGE電泳緩沖液（BN20116）為10×Tris-甘氨酸電泳緩沖液，常用于蛋白變性聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，10×濃縮液，便于儲存、操作簡便。 

三、轉(zhuǎn)膜

轉(zhuǎn)膜是將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體上，同時(shí)維持其相對位置和分辨率的過程,主要分兩種：濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。半干轉(zhuǎn)耗時(shí)短，但是更適合小分子蛋白的轉(zhuǎn)印，而濕轉(zhuǎn)蛋白分子量范圍較寬，兩者的比較見表在 Western Blot 實(shí)驗(yàn)中，常用的是濕轉(zhuǎn)。

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百瑞極10×電泳轉(zhuǎn)移緩沖液（BN20181）是用于中濕法以及半干法電泳轉(zhuǎn)膜的緩沖試劑，為10×濃縮液，不含 SDS 和甲醇，便于儲存、操作簡便。

百瑞極WB 封閉液(BN21013)用于轉(zhuǎn)移后蛋白的NC膜或PVDF膜非特異性結(jié)合位點(diǎn)的封閉，可以減少后續(xù)的一抗或二抗與膜的非特異性結(jié)合，降低背景著色，增強(qiáng)信噪比。

百瑞極膜再生液（BN21014）可以對同一張膜進(jìn)行多次WB檢測，特點(diǎn)是無毒、無味、無害，室溫下使用，室溫下保存，可對同一張膜進(jìn)行 5 次以上的WB檢測。

四、免疫反應(yīng)與檢測

轉(zhuǎn)膜后凝膠中的蛋白被固定在膜上，需要有效檢測目標(biāo)蛋白，定性及定量樣品中蛋白質(zhì)與對應(yīng)豐度。蛋白印跡檢測使用針對目標(biāo)蛋白具有特異性的一抗，再雜交酶或熒光分子標(biāo)記的二抗，然后進(jìn)行檢測。正確選擇、使用合適的一抗和二抗對于最大化信號，同時(shí)降低背景至關(guān)重要。蛋白上樣內(nèi)參的正確使用對于蛋白印跡的信號歸一化也至關(guān)重要。

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百瑞極Western一抗/二抗稀釋液（BN21010/21012）是新一代的高效抗體稀釋液，總體效果顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的基于BSA(牛血清白蛋 白)、脫脂奶粉等的抗體稀釋液，有效節(jié)約抗體，稀釋液不含血清和白蛋白，確保極高的信噪比。

百瑞極羊抗兔IgG-HRP標(biāo)記（BN20601）、羊抗小鼠IgG-HRP標(biāo)記（BN20602），為常用HRP標(biāo)記二抗。

百瑞極超敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（BN16009）為免疫印跡實(shí)驗(yàn)提供明亮的信號和低皮克級檢測靈敏度，ECL底物能夠兼容各種膜、封閉液和寬范圍抗體稀釋液，以出色性能、通用性和高性價(jià)比，滿足用戶的免疫印跡應(yīng)用需求。