鎳-瓊脂糖凝膠FF主要用于純化帶組氨酸標(biāo)簽（His-Tag）的重組蛋白。純化原理是利用重組蛋白組氨酸標(biāo)簽的咪唑環(huán)可與過渡金屬Ni2+形成穩(wěn)定的配位鍵，因此能特異、牢固、可逆地吸附于固定這些金屬離子的基質(zhì)，結(jié)合了His-Tag重組蛋白的鎳-瓊脂糖凝膠FF一般通過增加咪唑濃度進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)洗脫。
一、填料結(jié)構(gòu)
固定相是由基質(zhì)、間隔臂、螯合劑和金屬離子四部分組成。螯合劑是指將金屬離子固定在基質(zhì)上的物質(zhì)，與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的活性基團(tuán)。目前常見螯合劑有IDA、NTA、TED。結(jié)構(gòu)如下：
二、如何選擇不同螯合劑的鎳柱？
鎳有6個(gè)配位，IDA與鎳結(jié)合時(shí)會(huì)占據(jù)3個(gè)配位，剩余3個(gè)配位與目標(biāo)蛋白的His標(biāo)簽上的組氨酸結(jié)合。
NTA與鎳結(jié)合時(shí)會(huì)占據(jù)4個(gè)配位，剩余2個(gè)配位
EDA與鎳結(jié)合時(shí)會(huì)占據(jù)5個(gè)配位，剩余1個(gè)配位
示意圖如下：
因?yàn)殒嚨呐湮皇怯邢薜?，所以螯合劑與金屬離子結(jié)合力越強(qiáng)，它與蛋白結(jié)合能力越弱。如下圖所示：
不同配基
除常見親和層析柱的配基--鎳以外，還有其他的金屬離子作為配基，它們與蛋白親和力與特異性呈現(xiàn)相反趨勢(shì)。
螯合劑可選擇不同金屬離子作為配基，除上文介紹的IDA、NTA、TED三種螯合劑外，還有IMAC。
它們?cè)隍辖饘匐x子后可用于富含組氨酸、色氨酸、半胱氨酸的蛋白質(zhì)純化，其中最常見的是用于融合了6-8個(gè)組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)純化。
與IDA瓊脂糖凝膠FF相比，IMAC瓊脂糖凝膠FF一般可以更牢固的結(jié)合金屬離子，在純化標(biāo)簽蛋白方面，有可能獲得更高純度的樣品。
鈷瓊脂糖凝膠FF預(yù)裝柱
純化原理是利用重組蛋白組氨酸標(biāo)簽的咪唑環(huán)可與過渡金屬Co2+形成穩(wěn)定的配位鍵,因此能特異、牢固、可逆地吸附于固定這些金屬離子的基質(zhì),結(jié)合了His-Tag 重組蛋白的鈷瓊脂糖凝膠FF一般通過增加咪唑濃度進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)洗脫。
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